Les personnages de Vol au dessus d'un nid de coucou se composent de patients d'un hôpital psychiatrique de l'Oregon, de son personnel et de quelques autres personnages sur la même orbite.
Héros de la guerre de Corée, Randle Patrick McMurphy est le protagoniste du roman, et il s'est fait admettre à l'hôpital pour éviter le travail forcé. Il venait de Pendelton Prison Farm, où il a réussi à être diagnostiqué comme psychotique, malgré le fait qu'il était sain d'esprit. Travailleur manuel rebelle et anti-académique qui s'adonnait au jeu, aux remarques sexuelles dérangeantes et autres pitreries, il devient de facto le leader des patients. Il leur apprend à remettre en question les enseignements arbitraires et répressifs de l'infirmière Ratched. Il vient à l'hôpital croyant que son passage dans la salle de psychologie serait plus confortable qu'une peine à la ferme de travail de Pendleton.
Cependant, malgré son autodétermination, l'hôpital prend le contrôle de lui. Son sort est préfiguré par ce qui arrive à Maxwell Taber, un ancien patient à tête chaude qui a été soumis à un traitement par électrochocs, qui l'a laissé incapable de penser.
L'infirmière Ratched attribue la mort de l'un des détenus à lui et, par conséquent, il l'attaque. Cela se traduit par une lobotomie, et finalement il est tué dans son sommeil par le chef Bromden. Lui et Bromden ont des arcs d'histoire opposés: Bromden commence sobre et apparemment stupide, pour ensuite revenir à ses sens; McMurphy, d'autre part, est affirmatif et intelligent au début du roman, mais finit par être lobotomisé et euthanasié.
Le chef Bromden est le narrateur du roman, un homme d'origine mixte amérindienne et blanche. Diagnostiqué comme un schizophrène paranoïaque, il prétend être sourd et muet afin d'esquiver les forces du «Combine», une matrice qui bourdonne derrière les murs et les sols qui priverait les individus de leur liberté. Il est à l'hôpital depuis plus de 10 ans, plus longtemps que tout autre patient. «Ce n'est pas moi qui ai commencé à devenir sourd; ce sont les gens qui ont commencé à agir comme si j'étais trop stupide pour entendre, voir ou dire quoi que ce soit », se rend-il compte finalement.
McMurphy le réhabilite et, à la fin, tous deux se rebellent activement contre le personnel répressif de l'hôpital. Après que l'infirmière Ratched ait lobotomisé McMurphy, le chef le tue - en fait, l'euthanasie - pendant qu'il dort, puis s'échappe de l'hôpital.
Nurse Ratched est l'antagoniste du roman. Elle est une ancienne infirmière de l'armée, également connue sous le nom de «Big Nurse», et a un comportement semblable à une machine, même si, parfois, sa façade s'effondre et elle montre son côté laid.
Elle est la dirigeante de facto du service et maintient l'ordre en exerçant une autorité absolue sur le personnel et les patients. Elle peut agir à la fois comme un «ange de miséricorde» et comme une tortionnaire, car elle connaît tous les points faibles de ses patients, au point qu'elle utilise principalement la honte et la culpabilité pour exercer son pouvoir.
Ses gros seins, en quelque sorte, sont considérés comme une force sape dans sa quête d'une autorité absolue et lui donnent l'apparence d'une figure de mère tordue. Étant donné que McMurphy représente la quintessence de la masculinité brute, il agit comme une force opposée à l'infirmière Ratched, qui sent qu'elle a besoin de le contrôler. McMurphy compare les techniques de Nurse Ratched avec les bouffonneries de «lavage de cerveau» utilisées par les communistes pendant la guerre de Corée.
Patient «aigu», il est un homme diplômé de l'université qui s'est engagé volontairement dans le service. Il est assez efféminé et a été castré psychologiquement par l'infirmière Ratched et sa femme.
Billy Bibbit est un homme de 31 ans avec une mère dominatrice, au point que, malgré son âge adulte, il est toujours vierge. Aigu volontairement engagé, Bibbit parvient à perdre sa virginité face à la prostituée Candy Starr (grâce à l'arrangement de McMurphy). Une fois attrapé par l'infirmière Ratched, il est honteux par elle et, en attendant dans le bureau du médecin, il meurt en se tranchant la gorge. Il a des marques aux poignets, dénotant des tentatives de suicide antérieures.
Cheswick est le premier patient à suivre la position rebelle de McMurphy. Cependant, une fois que McMurphy est maîtrisé, Cheswick se noie quand on lui refuse ses cigarettes.
L'une des infirmières du service psychiatrique, elle n'est pas d'accord avec les méthodes de l'infirmière Ratched et est le seul personnage féminin qui n'est ni une «putain» ni une «coupeuse de balles».