Procédure de coloration de Gram en microbiologie

La coloration de Gram est une méthode différentielle de coloration utilisée pour attribuer des bactéries à l'un des deux groupes (Gram positif et Gram négatif) en fonction des propriétés de leurs parois cellulaires. Il est également connu sous le nom de coloration de Gram ou méthode de Gram. La procédure porte le nom de la personne qui a développé la technique, le bactériologiste danois Hans Christian Gram.

Comment fonctionne la coloration de Gram

La procédure est basée sur la réaction entre le peptidoglycane dans les parois cellulaires de certaines bactéries. La coloration de Gram implique la coloration des bactéries, la fixation de la couleur avec un mordant, la décoloration des cellules et l'application d'un contre-colorant.

1. La tache primaire (cristal violet) se lie au peptidoglycane, colorant les cellules en violet. Les cellules gram-positives et gram-négatives ont des peptidoglycanes dans leurs parois cellulaires, donc au départ, toutes les bactéries se colorent en violet.
2. L'iode de Gram (iode et iodure de potassium) est appliqué comme mordant ou fixateur. Les cellules à Gram positif forment un complexe cristal violet-iode.
3. L'alcool ou l'acétone est utilisé pour décolorer les cellules. Les bactéries à Gram négatif ont beaucoup moins de peptidoglycane dans leurs parois cellulaires, donc cette étape les rend essentiellement incolores, tandis que seule une partie de la couleur est retirée des cellules à Gram positif, qui ont plus de peptidoglycane (60 à 90% de la paroi cellulaire). La paroi cellulaire épaisse des cellules gram-positives est déshydratée par l'étape de décoloration, ce qui les fait rétrécir et piéger le complexe tache-iode à l'intérieur.
4. Après l'étape de décoloration, une contre-coloration est appliquée (généralement de la safranine, mais parfois de la fuchsine) pour colorer les bactéries en rose. Les bactéries gram-positives et gram-négatives ramassent toutes les taches roses, mais elles ne sont pas visibles sur le violet plus foncé des bactéries gram-positives. Si la procédure de coloration est effectuée correctement, les bactéries gram-positives seront violettes, tandis que les bactéries gram-négatives seront roses.

Objectif de la technique de coloration de Gram

Les résultats de la coloration de Gram sont visualisés en microscopie optique. Parce que les bactéries sont colorées, non seulement leur groupe de coloration de Gram est identifié, mais leur forme, leur taille et leur agglomération peuvent être observées. Cela fait de la coloration de Gram un outil de diagnostic précieux pour une clinique médicale ou un laboratoire. Bien que la tache n'identifie pas définitivement les bactéries, il suffit souvent de savoir si elles sont à Gram positif ou à Gram négatif pour prescrire un antibiotique efficace.

Limites de la technique

Certaines bactéries peuvent être gram-variables ou gram-indéterminées. Cependant, même ces informations peuvent être utiles pour réduire l'identité bactérienne. La technique est la plus fiable lorsque les cultures ont moins de 24 heures. Bien qu'il puisse être utilisé sur des cultures de bouillon, il est préférable de les centrifuger en premier. La principale limitation de la technique est qu'elle donne des résultats erronés si des erreurs sont commises dans la technique. La pratique et les compétences sont nécessaires pour produire un résultat fiable. De plus, un agent infectieux peut ne pas être bactérien. Les agents pathogènes eucaryotes sont colorés à Gram négatif. Cependant, la plupart des cellules eucaryotes à l'exception des champignons (y compris la levure) ne collent pas à la lame pendant le processus.

Procédure de coloration de Gram

Matériaux

• Violet cristal (tache primaire)
• Iode de Gram (mordant, pour fixer le cristal violet dans la paroi cellulaire)
• Éthanol ou acétone (décolorant)
• Safranine (coloration secondaire ou contre-coloration)
• De l'eau dans une bouteille à gicler ou un flacon compte-gouttes
• Lames de microscope
• Microscope composé

Pas

1. Placer une petite goutte d'échantillon bactérien sur une lame. Fixez à chaud les bactéries sur la lame en la faisant passer trois fois à travers la flamme d'un brûleur Bunsen. Appliquer trop de chaleur ou trop longtemps peut faire fondre les parois cellulaires des bactéries, déformer leur forme et conduire à un résultat inexact. Si trop peu de chaleur est appliquée, les bactéries laveront la lame pendant la coloration.
2. Utilisez un compte-gouttes pour appliquer la teinture principale (violet cristal) sur la lame et laissez-la reposer pendant 1 minute. Rincez délicatement la lame avec de l'eau pas plus de 5 secondes pour enlever l'excès de tache. Un rinçage trop long peut éliminer trop de couleur, tandis qu'un rinçage trop long peut laisser trop de taches sur les cellules gram-négatives.
3. Utilisez un compte-gouttes pour appliquer l'iode de Gram sur la lame pour fixer le cristal violet à la paroi cellulaire. Laisser reposer 1 minute.
4. Rincer la lame avec de l'alcool ou de l'acétone pendant environ 3 secondes, puis immédiatement avec un rinçage doux à l'eau. Les cellules gram-négatives perdront leur couleur, tandis que les cellules gram-positives resteront violettes ou bleues. Cependant, si le décolorant reste trop longtemps, toutes les cellules perdront leur couleur!
5. Appliquer la teinture secondaire, la safranine, et laisser reposer pendant 1 minute. Rincer doucement avec de l'eau pas plus de 5 secondes. Les cellules gram-négatives doivent être colorées en rouge ou en rose, tandis que les cellules gram-positives apparaissent toujours violettes ou bleues.
6. Visualisez la diapositive à l'aide d'un microscope composé. Un grossissement de 500x à 1000x peut être nécessaire pour distinguer la forme et la disposition des cellules.

Exemples d'agents pathogènes à Gram positif et à Gram négatif

Toutes les bactéries identifiées par la coloration de Gram ne sont pas associées à des maladies, mais quelques exemples importants incluent:

• Cocci à Gram positif (rond): Staphylococcus aureus
• Cocci à Gram négatif: Neisseria meningitidis
• Bacilles à Gram positif (bâtonnets): Bacillus anthracis
• Bacilles à Gram négatif: Escherichia coli